冷冻切片,顾名思义就是使组织样本冷冻后获得一定硬度而制作的切片。冷冻切片使用范围很广,如酶活性的检测等。在临床病理工作中,快速冷冻诊断报告直接为临床手术医生提供了手术指导,并为手术方案的选择提供了依据。
冷冻切片技术最早在1818年就出现了,1905年成功完成了第一例冷冻切片诊断。早年的冷冻切片机主要是二氧化碳制冷的开放式切片机,随后过渡到半导体冷冻切片机、箱体恒温冷冻切片机等,直到目前的恒温冷冻切片机。恒温冷冻切片机也在不断改进。好的切片机除了有精密的切片装置外,还有快速双重制冷、自动除霜、自动消毒及负压等功能。先进的制冷系统,安全与环保性能及操作方便是优良冷冻切片机的保证。快速冷冻模式可以保证样本快速冷冻,减少冰晶的生成,不影响诊断。
1.组织包埋液包埋 目前大多数情况下,在冷冻切片时,组织样本是不固定的,取材后需用组织包埋液包埋。在冷冻机中,冷室、组织块、包埋剂及切片刀之间的温度平衡于优化的切片温度(optimum cutting temperature,OCT)附近,是获得高质量冷冻切片的保证。不同的组织因构成各异而具有不同的OCT,当冷冻组织在接触刀刃的瞬间,局部温度短暂升高发生局部融化;随后切开的组织薄片暴露于冷室被再次骤冷冰冻,这种融化-冰冻温度变化是切片皱褶或断裂的内在原因,在此基础上,切片的软硬度和厚薄进一步影响皱褶产生。在切片过程中,冷冻包埋剂也须历经与组织类似的温度变化,这就要求包埋剂必须具有与组织块相近的冷冻速度和软硬韧度。目前常用的OCT冷冻切片包埋剂(OCT compound)是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物,在冷冻切片时支撑组织,以增加组织的连续性,减少皱褶及碎裂,同时因其为水溶性,故在漂片时可溶于水,所以在以后的染色中不会增加背景染色。
2.快速冷冻组织 为了避免冰晶的产生,组织需要及时快速冷冻。冷冻切片机的两个部分,快速冷冻台和冷冻锤,可以提高冷冻效果。冷冻台可让组织冷冻包埋液迅速受冷结冰发白,冷冻锤轻轻压在需要被切组织样本表面,进一步加快冷冻速度同时有表面取平效果更好。如有配套快速冷冻仪,组织可以在很短时间冷冻到最佳状态,特别是对带有脂肪的组织如更好。实验室的快速冷冻方法:先用干冰(-78.5℃)放入丙酮中,使之成为糊状,然后放一装有适量异戊烷的小烧杯,异戊烷到达-40℃左右,就可以很好地冷冻组织样本。也可用氮(-196℃)冷冻,但是液氮超低温度会使组织碎裂,所以液氮常用于保存组织。
3.切片时间的控制 大部分组织可以在-25~-20C制备冷冻切片。冷冻切片的制和石蜡切片制备有相同之处,需要粗修,细修和切片3步,但是冷冻切片更需要注意切片时的控制。冷冻切片机有防卷装置,切片时需要调节好防卷板位置,可以帮助得到满意的片。也有冷冻切片机附带一个防卷爪,切片时小爪子会轻轻地带着切片拉平。熟练的切技师也可用毛笔带着组织周边OCT轻轻地随着切片机上下运动带动切片走动,保持切片的平整。可用冷冻的毛笔帮助切片进一步展开后,用室温的载玻片贴片(裱片)。这个动作也是冷冻切片的特别之处,需要轻巧、准确和快速。冷冻切片如果后续用于复杂检测项目,或有些组织容易掉片的,建议用防脱载玻片。
冷冻切片制备后应及时固定,只有脑组织贴片后稍微晾干后再固定会更好。固定液有 FAA液、95%乙醇、丙酮、10%中性福尔马林缓冲液和 AF 液等。可根据切片用途来选择如 HE 染色可选用 FAA 液和 95%乙醇。临床病理学的冷冻切片需要及时观察而出具告,冷冻制片过程一般10分钟,留给HE染色的时间为5分钟左右,时间控制要求比较严格。
合格的冷冻切片标准为:切片完整,厚薄均匀,无褶无刀痕,组织无明显冰晶,无污染,色核质对比合适,切片脱水透明清晰,裱片封片美观干净。